آزمایشگاه میکروب شناسی 1 - جزوه عملی درس میکروب شناسی I
توضیحات
آزمایشگاه میکروب شناسی 1 - جزوه عملی درس میکروب شناسی I مشاهدة میکروسکوپی سلول های زنده (باکتری ها ، پروتوزئرها و جلبک ها) با استفاده از خیساندة یونجه. 1 اصول رنگ آمیزی – رنگ آمیزی ساده 3 رنگ آمیزی منفی.. 5 :رنگ آمیزی گرم. 6 رنگ آمیزی اسپور 9 رنگ آمیزی کپسول.. 11 رنگ آمیزی فلاژل.. 12 رنگ آمیزی دانه های متاکروماتیک (ولوتین) 13 رنگ آمیزی دانه های چربی.. 14 رنگ آمیزی هسته. 15 آشنایی با میکروارگانیسم ها –باکتری ها 16 آشنایی با میکروارگانیسم ها – قارچ ها 17 آشنایی با میکروارگانیسم ها-پروتوزئرها 19 اصول محیط کشت سازی.. 21 طرز تهیه کشت خالص از باکتری (روش Streak یا خطی) 24 مرفولوژی کلنی باکتری ها 25 بررسی و مطالعه میکروب های طبیعی بدن.. 27 میکروبیولوژی شیر 29 موضوع آزمایش: مشاهدة میکروسکوپی سلول های زنده (باکتری ها ، پروتوزئرها و جلبک ها) با استفاده از خیساندة یونجه. مقدمه: برای اینکه باکتری ها در حین مطالعة میکروسکوپی زنده بمانند باید در یک محیط مایع قرار داشته باشند و از آن جایی که اغلب باکتری ها در صورت فقدان رطوبت در محیط به سرعت از بین می روند برای مشاهده باکتری ها به صورت زنده دو روش آماده سازی وجود دارد: روش لام مرطوب (Wet mount): در این روش قطره ای از محیط کشت حاوی ارگانیسم را روی لام قرار داده و آن ها را به صورت زنده مطالعه می کنند. روش قطره معلق (Hanging drop): در این روش دور تا دور لامل را با یک چوب کبریت آغشته به پارافین کرده و یک قطره از محیط کشت را در وسط لامل قرار می دهند. سپس لامل روی یک لام توگود برگردانده شده و قطره از لامل آویزان می گردد. پارافین مانع از پخش شدن بیش از حد قطره آب و تبخیر شده و سبب می شود لامل در جای خود ثابت بماند. این روش تصاویر خوبی از حرکت میکروب ها ارائه می دهد. استفاده از لام مرطوب امکان مطالعات زیر را فراهم می کند: الف- اندازه و شکل ارگانیسم ب- نحوه خاص آرایش سلول های باکتری ج- تحریک یا عدم تحرک ارگانیسم چون در یک لام رنگ آمیزی شده اندازه و ترتیب واقعی باکتری ها و همچنین حرکت آن ها مشاهده نمی شود برای تهیه لام مرطوب می توان از خیساندة یونجه (Hay infusion) استفاده کرد. بدین منظور می توان در یک ارلن 1500-1000 میلی لیتری حدود 700-600 میلی لیتر آب ریخته و یک مشت علف مشاهدة میکروسکوپی سلول های زنده (باکتری ها ، پروتوزئرها و جلبک ها) با استفاده از خیساندة یونجه. خشک یا یونجه به آن اضافه کرد. بعد از 5-3 روز در هوای آزمایشگاه و هوادهی میکروارگانیسم های مختلفی شروع به رشد و فعالیت می کنند. پس از این مدت در اثر رشد و تکثیر میکروارگانیسم ها آب ارلن کدر می شود. در این آزمایش میکروارگانیسم های غالبی که مشاهده می شوند انواع باکتری ها، پروتوزوئرها و جلبک ها خواهند بود. برای مطالعه بهتر است از عدسی شیئی 40 استفاده شود چون استفاده از روغن برای مشاهده با عدسی 100 موجب چسبیدن لامل به عدسی شیئی می شود و در نتیجه هنگام تنظیم میکروسکوپ لامل جابجا شده و نمونه به وضوح قابل رویت نخواهد بود دوم این که لام مرطوب به سرعت خشک می شود (طی10 دقیقه) سوم این که میکروارگانیسم رنگ نشده تقریبا دارای همان ضریب شکست لازم شیشه ای و محیط مایع اطراف خود می باشد بنابراین برای تشخیص میکروارگانیسم ها از محیط مایع اطراف آن باید شدت نور را کاهش داد. کاهش شدت نور با بستن دیافراگم انجام می شود در صورتی که باز هم میزان نور برای لام مرطوب زیاد باشد می توان کندانسور را نیز پایین برد و بالاخره ممکن است مقداری پارافین به عدسی شیئی برسد که باعث تیرگی دید خواهد شد. وسایل و مواد مورد نیاز: لام میکروسکوپی ، لامل ، پارافین ، خیسانده یونجه ، چوب کبریت ، قطره چکان. روش کار: ابتدا روی یک لامل تمیز با استفاده از چوب کبریت دور تا دور لامل را آغشته به پارافین کرده سپس در مرکز لامل به کمک قطره چکان یا لوپ از نمونه مورد نظر قطره ای قرار دهید. لام را با لامل مماس کنید. در حالی که دو انتهای لام را در دست دارید آن را برگردانید تا لامل به سمت بالا قرار گیرد. در صورتی که لامل مسطح یا در تماس کامل با لام نباشد به آرامی با نوک مداد آن را روی لام فشار دهید. قطره خیسانده یونجه پخش شده و به این ترتیب نمونه آماده می شود. سپس میکروارگانیسم ها را با عدسی 10 و حداکثر عدسی 40 از نظر شکل و حرکت بررسی کنید. برای مشاهده بهتر میکروارگانیسم ها بهتر است از گوشه های لامل استفاده شود. موضوع آزمایش2: اصول رنگ آمیزی – رنگ آمیزی ساده مقدمه: رنگ ماده ایی است که به ساختمان سلولی متصل شده و آن را رنگ می کند. با رنگ آمیزی مشاهده میکروارگانیسم ها ساده تر شده و به طبقه بندی میکروارگانیسم ها کمک می کند. رنگ های مورد استفاده در رنگ آمیزی باکتری ها از قطران زغال سنگ به دست آمده و به دو گروه اسیدی و قلیایی تقسیم می شوند. رنگ های اسیدی نمک هایی هستند که قسمت رنگی آن ها اسیدی است در حالی که در رنگ های قلیایی قسمت رنگی خاصیت قلیایی دارد. در میکروبیولوژی بیشترین رنگ های مورد استفاده قلیایی یا کاتیونیک (پس از یونیزاسیون بار مثبت پیدا می کنند) هستند مانند متیلن بلو ، کریستال ویوله ، سافرانین و مالاشیت گرین. این رنگ ها به اجزا سلولی که دارای بار منفی هستند متصل می شوند دیوارة سلولی اکثر باکتری ها سطوحی با بار منفی دارند بنابراین رنگ های قلیایی با بار مثبت را جذب می کنند. به عنوان مثال تجزیه رنگ متیلن بلو به صورت زیر خواهد بود: موضوع آزمایش:رنگ آمیزی منفی مقدمه: در این روش باکتری ها رنگ نمی گیرند بلکه زمینه لام رنگ می شود این روش دو مزیت دارد: الف) شکل باکتری ها در اثر افزودن رنگ تغییر نمی کند. ب) باکتری های مورد مطالعه به اندازه طبیعی خود مشاهده می شوند. وسایل و موارد مورد نیاز: لام میکروسکوپی ، لوپ تلقیح ، رنگ نگروزین. روش کار: یک قطره بسیار کوچک از نگروزین را در وسط لام قرار داده و با لوپ استریل قسمتی از کلنی باکتری موجود در سطح محیط کشت را برداشته و در آن پخش نمائید. سعی کنید گسترش نازک باشد. سپس لام را در دمای آزمایشگاه خشک نمائید. سپس در زیر میکروسکوپ با عدسی روغنی 100 مشاهده کنید. باکتری ها در این روش به صورت فضاهای روشن در یک زمینه تیره مشاهده می شوند. بهتر است از کناره های گسترش که ضخامت کمتری دارند برای مشاهده استفاده شود. برخلاف رنگ آمیزی ساده در رنگ آمیزی منفی فیکساسیون (تثبیت) و شستشو پس از رنگ آمیزی انجام نمی گیرد