فایل ردیابی هیستوموناس مله اگریدیس در بوقلمون های کشتارشده

توضیحات

فایل ردیابی هیستوموناس مله اگریدیس در بوقلمون های کشتارشدهاین پایان نامه در قالب فرمت word قابل ویرایش ، آماده پرینت و ارائه به عنوان پروژه پایانی میباشد.به منظور ردیابی هیستوموناس مله اگریدیس در بوقلمون‌های کشتار شده در استان اصفهان، 200 نمونه خون و 200 نمونه کبد در کشتارگاه اخذ شد و پس از استخراج DNA، قطعه 550 جفت بازی مربوط به ژن 18SRNA تکثیر شد. علاوه بر آن، نمونه‌های کبد در فرمالین 10% نگهداری و پس از تهیه مقاطع پاتولوژی رنگ آمیزی با هماتوکسیلین - ائوزین از نظر وجود انگل مورد بررسی قرار گرفت. نتایج PCR نشان داد از 200 نمونه خون، 18 نمونه (9%) و از تعداد 200 نمونه کبد، 32 نمونه (16%) از لحاظ هیستوموناس مله اگریدیس مثبت می‌باشد. نتایج هیستوپاتولوژی نشان داد از بین نمونه‌های PCR مثبت 76/11 % در هیستوپاتولوژی مثبت ارزیابی شدند لذا به نظر می‌رسد برای شناسایی هیستوموناس مله اگریدیس PCR از ویژگی بالایی برخوردار می‌باشد -1- مقدمه در دهه‌های اخیر به دلیل رشد جوامع بشری، نیاز به منابع غذایی به خصوص اقلام پروتئینی حیوانی افزایش یافته است وپرورش بوقلمون به طور صنعتی به منظور رفع بخشی از این نیاز در سراسر جهان درحال گسترش می‌باشد.درسال2004 ایالات متحده باتولید 2592000 تن گوشت بوقلمون در رتبه نخست بوده است.درکشور ما نیز پرورش بوقلمون صنعتی در سال‌های اخیر رشد قابل توجهی داشته به طوری که تولید گوشت آن به صور مختلف قطعه بندی شده ویا لاشه قابل عرضه می‌باشد (5). در ایران صنعت پرورش بوقلمون از سال1355 آغاز گردیده وهرساله به تعداد مزارع بوقلمون درکشور اضافه می‌شود (1). باتوجه به خصوصیات پرورشی مناسب بوقلمون‌های گوشتی، نظیر میزان وزن گیری، سرعت رشد زیاد (74/10 کیلوگرم در16 هفتگی برای بوقلمون‌های ماده و 39/20 کیلوگرم در20 هفتگی برای بوقلمون‌های نر) ضریب تبدیل غذایی پایین،درصد اندک افت لاشه وارزش غذایی مناسب در مقایسه سایر طیور صنعتی،پرورش این پرنده به طور صنعتی به منظور رفع بخشی از این نیازها در سراسر جهان درحال گسترش است به طوری که در سال 2007 ایالات متحده، اتحادیه اروپا، برزیل و کانادا ازنظر تولید گوشت بوقلمون درسطح جهان به ترتیب دررتبه‌های اول تا چهارم قرار داشتند (7). 1-2- بیان مسئله هیستومونیازیس [1] بیماری تک یاخته‌ای حاد است. هیستوموناس مله اگریدیس[2] تک تاژک است. تک‌یاخته‌های انگلی باعث هپاتیت سکوم می‌شوند.سایت‌های هجومی این انگل سکوم و کبد می‌باشد واختلال گردش خون درمراحل بعدی این بیماری به نظر می‌رسد وباعث یک بیماری سرسیاه در پرنده می‌شود. در دهه‌های اخیر هیستومونیازیس موجب شده است تا آسیب جدی به صنعت طیور، به ویژه در میان بوقلمون وارد شود. موارد کمی از بروز بیماری در ماکیان نیز گزارش شده است ولی ماکیان به علت مقاومت در مقابل بیماری، بیشتر نقش مخزن بیماری را داشته و در صورت آلودگی به کرم هتراکیس گالیناروم[3]، نقش مهمی در انتقال بیماری به بوقلمونها بازی می‌نمایند. جوجه بوقلمونها با خوردن تخمهای آلوده هتراکیس به بیماری مبتلا می‌شوند. این بیماری انتشار جغرافیایی وسیعی در دنیا دارد. مشاهدات درمانگاهی وکالبدگشایی در ایران نشان دهنده‌ی حضور بیماری می‌باشد (29). 1-3- مروری بر سابقه تحقیق در مطالعه‌ای که توسط Cortes و همکاران (2004) در گله جوجه‌های تجاری با 6 هفته سن صورت گرفت نشان داد علائم کلینیکی شامل افسردگی و با آب و تاب راه رفتن، بی علاقگی وافزایش اندکی در مرگ و میر دارند. این اولین گزارش از حضور هیستومونیازیس در بورس فابرسیوس در جوجه‌های تجاری است (10). در مطالعه‌ای دیگر که توسط Hurst (1980) با موضوع بررسی هیستومونیازیس در بوقلمون‌های وحشی در می‌سی سی پی آمریکا صورت گرفت، نشان داد در جمعیت بوقلمون‌های وحشی با تراکم بالا، انگل هیستومونیازیس وجود دارد (19). در مطالعه‌ای دیگر که توسط Lotfi و همکاران (2012) انجام شد نشان داد انگل هیستومونیازیس در خارج از بدن میزبان به طور خیلی ضعیف زنده می‌ماند. این بررسی در شرایط مشابه مزرعه و در دمای اتاق بر روی چند ماده مصنوعی انجام گرفت که نتایج آن شامل: تک یاخته تا یک ساعت بر روی چوب، لاستیک وفلز، تا 3ساعت در جعبه‌های تخم مرغ، پوسته‌های تخم مرغ وآجر، تا 6ساعت در پر و بال و خوراک بوقلمون و تا 9 ساعت در آب لوله کشی کلر نزده و مدفوع زنده می‌ماند. بنابراین آب آلوده و مدفوع تازه و یا هر دو می‌توانند نقش مهمی در انتقال انگل بازی کنند (24). در مطالعه‌ای که توسط McDougald (2005) با موضوع هیستومونیازیس در پرندگان در رودایسلند انجام شد نشان داد که بیماری سر سیاه باعث مرگ و میر بالا در بوقلمون‌ها گاهی نزدیک به 100 درصد ودر جوجه‌ها میزان مرگ و میر ممکن است با عوارض بالا از 20 تا 100 درصد همراه باشد. دراین تحقیق نشان داده شد هیستومونیازیس به سرعت در گله‌ی بوقلمون از طریق تماس مستقیم پرندگان با یکدیگر پخش می‌شود و احتمالأ مربوط به پدیده کلوآک نوشی است. در این تحقیق بر وابستگی به هتراکیس گالیناروم به عنوان منبع عفونت ذکر شده است (29). در مطالعه دیگر که توسط Patra و همکاران (2013) در هند با هدف شناسایی میزان بروز هیستومونیازیس در پرندگان گوشتی از طریق مولکولی انجام شد نشان داد از 4000 پرنده مورد بررسی قرار گرفته 40 پرنده به هیستومونیازیس مله آگریدیس مبتلا بودند یا به عبارتی میزان شیوع 1 درصد بود (32). در گزارشی که توسط Popp و همکاران (2011) انجام شد نشان داد که مزرعه‌ای ارگانیک در جنوب آلمان به مدت 3 سال متوالی در میان جوجه‌های گوشتی و بوقلمون‌ها، شیوع یک بیماری شدید ناشی از انگل تک یاخته هیستومونیازیس مله اگریدیس رخ داده است و تشخیص از طریق DNA بوده است (33). در مطالعه‌ای دیگر که توسط Senties-Cue و همکاران (2009) انجام شد نشان داد در بوقلمون‌هایی با سن 7 تا 13 هفتگی علایمی همچون بی اشتهایی، افسردگی، اسهال، از دست دادن وزن و افزایش مرگ و میر داشتند. علائم کالبدگشایی آن شامل ضخیم شدن شدید دیواره سکوم، بزرگ شدگی بورس، پانکراس و طحال کم رنگ و زرد بود. میکروسکوپ الکترونی حضور هیستومونیازیس در کبد و سکوم را تایید کرد. این اولین گزارش حضور سیستمیک هیستومونیازیس موثر بر بورس فابرسیوس، کلیه‌ها، ریه، پانکراس و پیش معده در بوقلمون است (38). 1-4- اهداف، فرضیات و سوالات تحقیق 1-4-1- اهداف تحقیق 1-4-1-1- هدف کلی ردیابی انگل هیستوموناس مله آگریدیس در گله‌های بوقلمون استان اصفهان به روش PCR 1-4-1-2- اهداف جزئی برآورد میزان فراوانی 1-4-2- فرضیات تحقیق هیستومونیازیس دربوقلمون‌های اصفهان وجوددارد. 1-4-3- سئوالات تحقيق آیا هیستومونیازیس در بوقلمون‌های اصفهان وجود دارد؟ 1-5- روش تحقیق و پژوهش الف : نمونه گیری : به منظوربررسی آلودگی Histomoniasis Meleagridisدرگله‌های بوقلمون استان اصفهان، بامراجعه به کشتارگاه بوقلمون واقع دراستان اصفهان شامل شهرستانهای تیران و کرون و نجف آباد 200 نمونه خون و 200 نمونه کبد از 20 گله بوقلمون اخذ ونمونه‌ها درکنار یخ به آزمایشگاه منتقل گردید وتا زمان انجام آزمایشات دردمای20- درجه سانتی گراد نگه داری شد. ب : استخراج DNA نمونه خون وکبد پس از هموژن سازی با استفاده از کیت تخلیص DNA (Korea،(Bioneer استخراج می‌گردد. پرایمرهای مورد استفاده (Hmf،Hmr) براساس توالی منتشرشده توسط Liu و همکاران در سال 2011 سنتزگردید (22). مخلوط واکنش با حجم نهایی 25میکرولیتر شامل 4 میلی مول کلرید منیزیم، 5 میکرومول از پرایمر، 5/2 میکرولیتر از بافر Taq10x، 2/0 میکرومول از هر کدام dNTP‌ها،1/25 واحد از Taq DNA Polymerase و 2 میکرولیتر از نمونه DNA می‌باشد. دمای واکنش شامل واسرشت سازی اولیه 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه، همراه با 38 سیکل 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه (واسرشت سازی) 55 درجه سانتی‌گراد به مدت 1دقیقه (همسرشت‌سازی) و 72درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه (گسترش) همراه با 72 درجه سانتی گرادبه مدت 10 دقیقه گسترش نهایی می‌باشد. محصول PCR برروی ژل 5/1 درصد الکتروفورز شده و میزان آلودگی به مواد Histomoniasis Meleagridis مشخص شد.